外泌體circLPAR1通過與METTL3-eIF3h相互作用調節BRD4水平抑制結直腸癌腫瘤發生

外泌體是癌癥的重要生物標志物，含有豐富的環狀RNAs (circRNAs)。然而，外泌體circRNAs在結直腸癌(CRC)中的作用分子機制尚不清楚。circLPAR1被包裹在外泌體中，具有較高的穩定性，在CRC發生過程中，circLPAR1在血漿外泌體中的表達明顯降低，但術后恢復。外泌體circLPAR1與生物標志物CEA和CA19-9聯合分析，在CRC診斷中具有癌癥特異性。此外，circLPAR1在CRC組織中下調，并與總生存率相關。機制上，外泌體circLPAR1被CRC細胞內化，并抑制腫瘤生長，可能是因為外泌體circLPAR1直接與eIF3h結合，特異性地抑制了METTL3-eIF3h相互作用，減少了癌基因BRD4的翻譯。這項綜合研究強調了血漿外泌體circLPAR1作為CRC診斷的一個有前景的預測因子，并描述了其在結直腸癌發生中的生物學調節。本研究為疾病發展的發病機制提供了新的視角。本文于2022年2月發表于Molecular Cancer (IF=41.444)上。

技術路線：

主要研究結果：

(1) 下調的circLPAR1在結直腸癌中被包裹在外泌體中

為了描述結直腸癌中失調的circRNAs，我們對52對結直腸癌腫瘤和NATs進行了RNA-Seq，觀察到14221個circRNAs且其中大多數小于500 nt(圖1A-B)，其中超過70%的circRNAs起源于蛋白質編碼外顯子，其次是內含子和基因間區(圖1C)。在建立篩選標準后，倍數變化(FC)≥|2|且P<0.005，我們得到5個circRNAs在結直腸腫瘤組織中的表達明顯低于NATs(圖1D-E)。我們使用exoRBase數據庫注釋外泌體中的circRNAs，發現了三種外泌體circRNAs，由RNA-Seq測定，豐度較高(圖1F-G)。與正常FHC細胞相比，hsa_circ_0087960(來源于LPAR1，以下稱為circLPAR1)是唯一在結直腸癌細胞(HCT116和DLD1)中表達顯著下調的細胞系中得到驗證的circRNA(圖1H)。

隨后，我們從細胞培養基中純化了外泌體(FHC-Exos和HCT116/DLD1-Exos)，并觀察到典型的外泌體特征：直徑50–100 nm且呈杯狀，表達標記蛋白TSG101和Alix(圖1I-K)。circLPAR1在HCT116/DLD1-Exos中的表達低于FHC-Exos(圖1L)。外泌體分泌抑制劑GW4869處理后，細胞培養液中circLPAR1水平顯著降低(補充圖未展示)。

圖1：組織中circRNAs的分析和外泌體circLPAR1的選擇。從FHC、HCT116和DLD1細胞分離的外泌體分別命名為FHC-Exos、HCT116-Exos和DLD1-Exos

(2) circLPAR1在結直腸腫瘤中下調并與總生存率相關

circLPAR1是由位于chr9(113734352-113735838)上的LPAR1基因的外顯子3和外顯子4環狀生成。Sanger測序證明，circLPAR1長226 bp并有一個頭尾相連的后剪接位點(圖2A)。為了檢驗circLPAR1的穩定性，我們用放線菌素D處理結直腸癌細胞，并觀察到circLPAR1比線性LPAR1轉錄物更穩定(補充圖未展示)。與線性LPAR1轉錄本相比，circLPAR1對RNase R消化(線性RNA的降解劑)具有耐藥性(圖2B)。為了可視化circLPAR1的表達模式，我們使用包含79對結直腸腫瘤和NATs的組織微陣列進行了FISH分析，circLPAR1在結直腸腫瘤中的表達水平顯著低于NATs (P=0.001；圖2C-D)。circLPAR1主要表達并定位于細胞質(圖2E)。Kaplan-Meier分析表明，高circLPAR1水平的結直腸癌患者的總生存率明顯高于低circLPAR1水平的結直腸癌患者(HR=0.46，95%可信區間(CI)=0.24-0.87；P_log-rank=0.017；圖2F)。

圖2：circLPAR1在結直腸癌組織中的表達

(3) 血漿外泌體circLPAR1是結直腸癌診斷的特異性生物標志物

考慮到circLPAR1在結直腸癌腫瘤中的下調表達模式，我們推測circLPAR1由血漿外泌體攜帶，并作為結直腸癌的特異性生物標志物。每個分裂樣本在不同凍融循環或室溫維持不同時間(圖3A-B)后，血漿中外泌體circLPAR1水平沒有明顯變化(P>0.05)。結直腸癌患者的外泌體circLPAR1明顯低于無癌對照組(P<0.001)和息肉患者(P=0.039)，表明外泌體circLPAR1在從癌前到癌前的疾病發展過程中可能降低(圖3C)。我們在許多癌癥中發現了相似的外泌體circLPAR1表達模式(圖3C)，包括GC、BRCA、BLCA、CESC、KIRC和LUAD (P>0.05)，這些模式均與結直腸癌的模式有顯著差異(P<0.001)。結直腸癌切除后外泌體circLPAR1水平顯著升高(P=0.001；圖3D)。圖3E中的ROC曲線顯示，在AUC為0.858的情況下，可以通過測量外泌體circLPAR1來區分結直腸癌患者和無癌對照組(95% CI=0.786-0.930，P<0.001)。CEA和CA19-9是兩種結直腸癌診斷的臨床生物標志物，在患者血漿中顯著上調，但與外泌體circLPAR1比較，其AUC相對較低(CEA:AUC=0.706；Ca19-9:AUC=0.559；圖3E)。外泌體circLPAR1、CEA和CA19-9聯合使AUC值提高至0.875 (95% CI=0.809-0.941；P<0.001；圖3E)，敏感性和特異性分別為87.30%和76.30%。

圖3：血漿外泌體circLPAR1的表達模式及其對結直腸癌細胞表型的生物學影響。從HCT116和DLD1細胞分離的外泌體分別被命名為HCT116-Exos和DLD1-Exos。外泌體分別從轉染circLPAR1/對照表達質粒的HCT116和DLD1細胞中分離，即circLPAR1-Exos和NC-Exos

(4) 外泌體circLPAR1在細胞間傳遞并抑制細胞表型

我們探討了外泌體circLPAR1在結直腸癌發生中的生物學功能。熒光顯微鏡觀察到HCT116和DLD1細胞的細胞質中有PKH67綠色熒光染料，而非Exos組中未觀察到PKH67綠色熒光染料，提示HCT116/DLD1-Exos被結直腸癌細胞快速吞噬(圖3F)。我們從轉染了circLPAR1/NC載體(circLPAR1/NC-Exos)的結直腸癌細胞中分離出外泌體，發現直接與circLPAR1-Exos孵生顯著增加了HCT116和DLD1細胞中的circLPAR1水平(補充圖未展示)。外泌體circLPAR1顯著抑制結直腸癌細胞的增殖、集合體形成、侵襲和遷移(圖3G-I)，與直接過表達circLPAR1得到的結果相似(補充圖未展示)。

(5) 外泌體circLPAR1通過與eIF3h相互作用調節BRD4水平抑制結直腸癌腫瘤發生

circLPAR1在細胞系和組織的細胞質中富集(圖2E和4A)，促使我們分析受circLPAR1影響的特異性circRNA-RBP復合物。我們通過MS2-CP-Flag circRNA下拉試驗進行了蛋白質組學分析(圖4B)。圖4C-D證實了circLPAR1-MS2載體或MS2-CP的轉染效率。circRNA下拉產物富集捕獲蛋白MS2-CP-Flag，隨后捕獲的circLPAR1高度富集(圖4E)；這兩個實驗都表明了circRNA下拉實驗的成功特異性。接下來的質譜分析通過比較circLPAR1+MS2-CP轉染組和circLPAR1-MS2+MS2-CP轉染組，鑒定出23個分配給circLPAR1的候選RBPs(補充表未展示)。circLPAR1與6個RBPs顯著相關(MGN2、RL27A、SF3A3、SPT4H、IF4E2和eIF3h；P<0.05；圖4F)，其中4個RBPs (MGN2、RL27A、SF3A3和eIF3h)與其親本線性RNA呈正相關(補充表未展示)。

為了證實circLPAR1對eIF3h的結合親和力，我們確定了circLPAR1和eIF3h在結直腸癌細胞的細胞質中的共定位(圖4G)。RIP實驗證實，與NC/NC-Exos組細胞相比，經circLPAR1慢病毒載體轉染或與circLPAR1-Exos孵育的結直腸癌細胞中，circLPAR1或外泌體circLPAR1與eIF3h特異性沉淀(圖4H)。這表明外泌體circLPAR1直接與eIF3h相互作用。eIF3h與METTL3之間存在直接的物理和功能相互作用，可以調節BRD4的翻譯，影響腫瘤發生(圖4I)。如圖4J所示，與NC/NC-Exos組相比，經circLPAR1慢病毒載體轉染或經circLPAR1-Exos孵育的結直腸癌細胞中，circLPAR1降低了BRD4蛋白水平。BRD4表達質粒提高了circLPAR1表達導致的BRD4水平下降，促進了結直腸癌細胞表型的獲得，而AZD5153逆轉了高BRD4水平的促瘤作用(補充圖未展示)。circLPAR1可以海綿miR-762促進膀胱癌的侵襲轉移。我們測量了上述circRNA下拉產物中的miR-762水平，但沒有發現miR-762與circLPAR1一起富集(補充圖未展示)。

圖4：外泌體circLPAR1通過結合eIF3h調節BRD4翻譯。將circLPAR1和對照慢病毒載體分別轉染到DLD1細胞，分別作為circLPAR1組和NC組。從轉染circLPAR1和對照慢病毒載體的DLD1細胞中分離外泌體，分別作為circLPAR1-Exos組和NC-Exos組

(6) 外泌體circLPAR1在體內抑制結直腸癌生長

為了在體內驗證外泌體circLPAR1對結直腸癌的抑制作用，我們將穩定的circLPAR1/NC-過表達細胞或1,1-二八胱氨酸-3,3,3,3四甲基多三碳氰化鈉(DiR)染色的circLPAR1/NC-Exos注射到人化的NCG小鼠體內(圖5A)。與體外結果一致，與NC表達或NC-Exos處理相比，circLPAR1過表達或circLPAR1-Exos處理降低了腫瘤的平均大小和重量(圖5B-C)。circLPAR1和circLPAR1-Exos組腫瘤組織的生長速度比NC/NC-Exos組腫瘤組織的生長速度慢(圖5D)?；铙w成像結果還顯示，DiR染色的circLPAR1/NC-Exos成功注射到小鼠體內(圖5E)。與NC/NC-Exos組相比，circLPAR1或circLPAR1-Exos組腫瘤的circLPAR1水平更高(補充圖未展示)。蘇木素和伊紅(H&E)染色和免疫組化(IHC)分析顯示circLPAR1和circLPAR1-Exos組Ki67和BRD4受損(圖5F-G)。

圖5：體外靶向外泌體cricLPAR1的作用。將經circLPAR1/NC慢病毒載體轉染的DLD1細胞株注射到人源化的NCG小鼠體內，分別標記為circLPAR1和NC，再將DiR標記的circLPAR1/NC-Exos注射到NC小鼠體內，分別標記為circLPAR1-Exos和NC-Exos

結論：

本研究強調了一種新的結直腸癌相關circRNA，稱為外泌體circLPAR1，它在從血漿中獲得的外泌體中檢測到，可能作為一種非侵入性生物標志物，用于結直腸癌的早期檢測。機制上，外泌體circLPAR1表達水平導致BRD4水平下降，因為它結合eIF3h并抑制METTL3-eIF3h相互作用，從而顯著抑制結直腸癌的發展。本研究不僅報道了外泌體circRNA在結直腸癌中的新機制，而且為結直腸癌的診斷方法開辟了新的途徑。

參考文獻：

Zheng, R., Zhang, K., Tan, S., Gao, F., Zhang, Y., Xu, W., Wang, H., Gu, D., Zhu, L., Li, S., Chu, H., Zhang, Z., Liu, L., Du, M., & Wang, M. (2022). Exosomal circLPAR1 functions in colorectal cancer diagnosis and tumorigenesis through suppressing BRD4 via METTL3-eIF3h interaction. Molecular cancer, 21(1), 49. https://doi.org/10.1186/s12943-021-01471-y.